그람염색법

오늘은 그람 염색법에 대해 알아보려고 합니다.

 

세균의 분류.

 

 그람 염색법은 오랜 시간 동안 세균의 대략적인 분류에 이용되었다. 오늘날에도 미생물 실험에서 균주들을 분류하기 위해 사용되고 있다. 그람 염색법은 방법이 간단하고 확인이 간편하기 때문에 중등교육부터 고등교육 더 나아가 산업에서도 쓰이고 있는 염색법이다. 염색법엔 다양한 종류가 있다. 대표적으로 동물세포를 염색하는 메틸렌 블루, 전분을 확인하는 요오드 반응 같은 아주 간단한 염색법이 있다. 세균 염색법으로 세균의 캡슐 염색으로 세균의 세포벽 외부를 형성하는 점질층과 캡슐 구조를 활용한 염색법이 있고, 세포가 에너지원으로서 지방을 과립이나 액적 형태로 저장하는 것을 이용한 지방과립 염색법 등이 있다.

 이 외에도 수많은 염색법이 있으나 그람 염색법이 오랫동안 아주 활용적으로 쓰이는 이유는 세균을 두 분류로 나누기 때문이다. 실제 학술적, 산업적 세균 분류에 있어서도 그람 양성균과 그람 음성균으로 분류한다. 미지의 미생물을 추적함에 있어서 그람 염색법처럼 큰 항목을 반드시 나누어 주는 염색법이나 추적법은 흔치 않으며, 그람 염색법의 개발로 미생물 추적 시간이 매우 짧아졌다고 볼 수 있다.

세포벽 구조차이가 그람염색법의 원리이다.

 현제 미생물 추적은 RNA 역전사 실시간 증폭 시험을 통해 미생물 유전 데이터 베이스에서 알고자 하는 미생물의 유전정보와 기존의 정보를 대조하여 추적하고자 하는 미생물을 정확하게 알려준다. 하지만 이러한 기술이 개발된 것은 비교적 최근의 일이다. 즉, 유전자 대조 추적 기술이 개발되기 전까지는 세균의 효소나 막단백질, 선택적 배지 배양 등의 시간이 오래 걸리는 추적 방법을 수행하여야만 하였다. 그러므로 그람 염색법처럼 세균을 2가지 선택지로 확실하게 알려주는 염색법, 즉 추적법은 미생물 관련 산업과 연구에 큰 도움을 주었다고 할 수 있다.

 

그람 염색법의 원리

 

 여기서 계속하여 그람 염색법이 이변 없이 딱 2가지로 세균을 분류한다고 하였는데, 그것이 가능한 이유는 세균의 세포벽의 구성이 단 2가지의 큰 형태로 분화했기 때문이다. 세균 세포벽의 형태는 두꺼운 세포벽을 가지고 있는 그람 양성균의 형태와 양성균에 비해 벽 두께는 얇지만 인지질 막을 벽 외부에 가지고 있는 그람 음성균의 형태만 존재한다. 그람 염색법의 원리는 이러한 두 세포벽 형태의 차이, 그중에서도 두께 차이에 따른 염색 정도를 활용한 것이다.

 

실험재료

 

그람 염색법의 방법에 대해 살펴보면, 우선 분석 실험 재료는 다음과 같다. 염색 후 결과 확인을 위한 광학 현미경이 필요하다. 시약으로는 푸른색 염색시약인 크리스털 블루, 염색을 고정하는 매염재로 그람 아이오딘, 분별 염색을 위한 탈색 시약으로 아세톤-이소프로판올, 2차 염색에 사용되는 염색약인 사프라닌 이 필요하다. 또한 미생물을 고정하고 염색하기 위한 공간인 슬라이드 글라스와 염색 종료 후 덮어줄 커버글라스도 필요하다. 마지막으로 고정을 위해 알코올램프가 준비되면 실험 준비가 끝난다.

 

실험방법

 

  먼저 슬라이드 글라스에 증류수를 1~2방울 떨어트린다. 이때 증류수를 너무 많이 사용하게 되면 균이 과도하게 희석되거나 외부에 시료가 오염되는 등의 문제가 있다. 앞으로 사용할 모든 시약들도 비슷한 이유로 용량은 소량, 약 1~2방울 정도가 적당하다.

 슬라이드 글라스 위에 증류수를 올렸으면 균체를 증류수에 희석하여야 한다. 배양한 시험대상 균체를 채취하여 증류수에 희석시켜주면 된다. 이후 고정 과정을 거치게 된다.

 고정은 슬라이드 글라스에 물리적으로 시료를 고정시키는 것을 말할 뿐만 아니라 관찰하고자 하는 세포의 상태를 관찰할 수 있도록 세포의 활동을 고정해주는 작업이다. 고정은 열 고정을 하며 슬라이드 글라스를 알코올램프를 사용하여 건조한다. 이때 시료가 열변성이 되지 않도록 주의해야 한다.

 고정을 한 뒤 크리스털 바이올랫 용액으로 염색을 1분간 진행한다. 이때 충분한 시간이 주어지지 않으면 염색이 잘 안되어 결과에 영향을 줄 수 있다.

 염색이 끝나면 흐르는 증류수에 직접 세척하지 말고 간접적으로 세척해야 한다.

 이후 매염을 위해 그람 요오드를 도포하고 1분 동안 매염한다. 매염이 끝나면 마찬가지로 흐르는 증류수에 간접 세척을 한다. 이제 탈색을 해준다.

 탈색은 과하지 않을 정도로 충분히 하는 것이 좋다. 탈색이 부족할 경우 염색 부족과 마찬가지로 실험 결과에 염향을 줄 수 있다. 탈색을 아세톤-이소프로판올로 1분 정도 탈색해준다. 마찬가지로 세척한 후 2차 염색을 사프라닌으로 40초간 진행해준다. 염색이 끝나면 세척 후에 건조를 충분히 하여 커버글라스를 덮어주고 광학 현미경을 이용하여 관찰하면 된다. 실험에 대한 결과와 그람 양성균과 음성균의 특징과 차이점은 다음 포스팅에서 이어서 진행하겠다.